Sát Thủ TVB xoay quanh anh chàng sát thủ có tiếng tên Diêm Võ (Lê Diệu Tường), vốn từng là nỗi khiếp sợ của giới giang hồ trong suốt nhiều năm. Tuy nhiên, một ngày nọ biến cố ập đến gia đình Võ khi cả nhà anh bị truy sát, kết quả là vợ mất mạng còn cô con gái Diêm Tố Chi (Mạch Minh Thi) thì bị mù. Từ đó, Võ bắt đầu tin vào luật nhân – quả, dần dần phong độ sa sút, anh trở thành sát thủ hạng bét. Chính từ đây mà sát thủ Kiều Tinh (Trần Hào) vượt lên, trở thành kẻ giết thuê mạnh nhất với biệt danh Zero, vỏ bọc của anh ta là một ông chủ tiệm cà phê hiền lành. Không những thế, những nhân viên làm việc trong quán của Tinh cũng là thành phần lai lịch bất minh được bảo vệ bởi bề ngoài lành tính.
Bà mẹ một con Tiền Hướng Thiến (Lý Giai Tâm) nợ nần chồng chất, sẵn sàng làm mọi việc cả chính lẫn tà để kiếm tiền. Cô gái xinh đẹp Lâm Sâm Sâm (Cao Hải Ninh) sáng bán cà phê, tối dọn dẹp hiện trường, xử lý thi thể cho các sát thủ. Trái ngược với Võ, sự nghiệp của Tinh lên như diều gặp gió, trong khi sát thủ mới nổi Lại Lan (Cung Gia Hân) cũng ra sức đàn áp, khiến Võ ngày càng khốn đốn, cuộc sống của anh ngày một chật vật, rồi còn bị Tố Chi xa lánh. May mắn thay, bên cạnh Võ vẫn có cô bạn thân Diêu Thục Nhàn (Giang Mỹ Nghi) quan tâm, chăm sóc, còn làm cầu nối tình cảm cho cha con anh. Tố Chi cũng dần tìm được hạnh phúc bên cạnh thiếu gia Quan Khải Dương (Tạ Đông Mẫn).
Ngoài việc cố gắng theo nghề, Võ vẫn luôn canh cánh trong lòng về kẻ bí ẩn được thuê để giết gia đình anh. Lúc này Tinh cũng âm thầm điều tra về cái chết của đồng đội nhiều năm về trước. Mọi manh mối vô tình dẫn Võ và Tinh về cùng một mục tiêu, đó là một thương gia nổi tiếng người Đài Loan. Hai người một là vua sát thủ và một sát thủ hạng bét đành phải phối hợp để làm sáng tỏ sự việc….